2024年1月2日，深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院茍德明教授團(tuán)隊(duì)在Nature出版社旗下期刊《Nature Communications》（影響因子：16.6）發(fā)表題為“Terminal modifications independent cell-free RNA sequencing enables sensitive early cancer detection and classification”的研究論文。深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院茍德明教授為通訊作者，王俊助理教授和黃金涌博士后為共同第一作者。
癌癥的早期診斷能夠延長患者的生存時(shí)間，增加治愈的可能性。隨著利用血漿中游離核酸進(jìn)行液體活檢在癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用，可能實(shí)現(xiàn)癌癥早期診斷。盡管基于游離DNA的檢測(cè)方法（基因突變、拷貝數(shù)變化、甲基化變化、片段模式變化等）已顯示出在檢測(cè)與分類癌癥上的高特異性，但結(jié)合游離轉(zhuǎn)錄組信息可以提高它們?cè)谠\斷早期癌癥的敏感性。血漿中游離RNA（cfRNA）代表了細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄本的動(dòng)態(tài)情況，腫瘤組織中相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的變化可以在血液中cfRNA水平的變化體現(xiàn)出來，因此cfRNA具有廣泛的臨床價(jià)值。血漿中的游離信使RNA（mRNA）已被證明具有組織和癌癥特異性及細(xì)胞起源特異性，可用于疾病診斷和預(yù)后評(píng)估。然而，全面解析血漿中cfRNA面臨兩個(gè)主要障礙。首先，cfRNA提取效率較低，需要大量血漿（至少2毫升）用于檢測(cè)。其次，cfRNA高度片段化，導(dǎo)致其具有多樣的末端修飾結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)的RNA-seq文庫制備流程只對(duì)具有完整修飾末端的RNA片段有效，無法勝任對(duì)cfRNA的測(cè)序文庫制備。因此，迫切需要能夠有效處理低豐度和高度片段化樣品的cfRNA分析新技術(shù)。
深圳大學(xué)茍德明教授團(tuán)隊(duì)長期致力于展非編碼RNA 在肺部疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床轉(zhuǎn)化研究，發(fā)明了Direct S-Poly(T)Plus等基于熒光定量PCR的小分子RNA定量檢測(cè)技術(shù)。為了滿足高通量的需求，該團(tuán)隊(duì)對(duì)此前技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，開發(fā)了靈敏的血漿cfRNA文庫制備技術(shù)（SLiPiR-seq），該技術(shù)具有不依賴RNA末端修飾的優(yōu)勢(shì)，因此即使只用微量血漿（至少100微升）也依然能得到準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。SLiPiR-seq對(duì)RNA的定量結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR技術(shù)具有很高的相關(guān)性。對(duì)比傳統(tǒng)的接頭連接文庫制備方法，SLiPiR-seq可以在血漿中檢測(cè)到更多種不同類型的RNA，其中， mRNA和長非編碼RNA（lncRNA）的檢出量大大增加。由于可以更多的檢出與基因表達(dá)和調(diào)控相關(guān)的RNA種類，SLiPiR-seq技術(shù)在揭示血漿轉(zhuǎn)錄本與病理機(jī)制的關(guān)聯(lián)等研究中具有很好的前景。
為了評(píng)估SLiPiR-seq 技術(shù)在肺癌檢測(cè)中的應(yīng)用效果，該研究對(duì)139 名肺癌患者和 106 名無癌癥個(gè)體的發(fā)現(xiàn)隊(duì)列進(jìn)行了回顧性分析?；?cfRNA 計(jì)數(shù)的負(fù)二項(xiàng)分布模型在病例和對(duì)照之間確定了12840個(gè)差異表達(dá)的 cfRNA（padj<0.1）。將上述隊(duì)列隨機(jī)分成 80％作為訓(xùn)練集，用來訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)診斷模型，將 20％作為測(cè)試集，用來評(píng)估模型的區(qū)分效果。本研究采用了邏輯回歸、隨機(jī)森林、支持向量機(jī)三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來系統(tǒng)地評(píng)估九類RNA的肺癌診斷效果。為了避免偏差，所有模型的隨機(jī)取樣和訓(xùn)練-測(cè)試過程均重復(fù)進(jìn)行了 100 次。九類RNA所訓(xùn)練的模型在測(cè)試集中均取得了較好的分類效果。為了進(jìn)一步評(píng)估診斷模型在檢測(cè)早期肺癌方面的效果，對(duì)來自另外兩個(gè)臨床中心的獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列進(jìn)行分析，該隊(duì)列包括26 名 I 期肺癌患者和27 名健康人。驚喜的是，mRNA（AUC=0.846）、miRNA（AUC=0.905）、snoRNA（AUC=0.788）、snRNA （AUC=0.903）和tsRNA（AUC=0.741）五類RNA所訓(xùn)練的模型可以精準(zhǔn)區(qū)分I 期肺癌患者和健康人。將這五類RNA組合來訓(xùn)練模型，發(fā)現(xiàn)由“mi+sn+sno”組成的模型具有最佳的早期肺癌檢測(cè)效果（AUC=0.979；發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中靈敏性96.40%，特異性97.81%；獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中靈敏性100%，特異性78.79%）。在大規(guī)模早期篩查中，為了避免假陽性，高特異性往往比高靈敏性更重要。因此，該研究指出由“m+sn+sno+ts”組合訓(xùn)練的模型具有更高的特異性（發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中靈敏性99.28%，特異性100%；獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中靈敏性76.92%，特異性95.24%），更加適合肺癌早篩的情景。
為評(píng)估SLiPiR-seq在多癌種分類的可行性，研究團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)額外對(duì)30例乳腺癌,37例結(jié)直腸癌,55例胃癌,15例肝癌進(jìn)行了血漿cfRNA檢測(cè)。通過機(jī)器學(xué)習(xí)分析,研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)通用的癌癥檢測(cè)模型和肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌五種癌癥特異的診斷分類模型,證明了cfRNA的差異表達(dá)譜在癌癥診斷和分類中具有強(qiáng)大的性能。因此,血漿cfRNA可以作為癌癥的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。
總結(jié)來說，本研究為深入研究血漿cfRNA的組成及其在疾病中的生物學(xué)意義奠定了基礎(chǔ)。下一步,研究團(tuán)隊(duì)將在大型樣本隊(duì)列中驗(yàn)證SLiPiR-seq技術(shù)的臨床應(yīng)用前景，期待基于該技術(shù)的cfRNA表達(dá)標(biāo)志物在未來可以實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確性的早期癌癥檢測(cè)分類的臨床應(yīng)用。
該研究得到了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82241022, 82170070, 81970053，89202586）、深圳市基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（JCYJ20210324120206017），深圳市高等院校穩(wěn)定支持項(xiàng)目（8940317-0109）的支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-44461-y
（來源 生命與海洋科學(xué)學(xué)院）
